肺癌已成为全球癌症死亡的首要原因，严重威胁人类健康。在肺癌患者中，非小细胞肺癌约占80%。EGFR是目前非小细胞肺癌治疗最重要的分子靶点，EGFR的磷酸化具有促肿瘤细胞生长、分化、侵袭、转移、抗凋亡以及促进肿瘤血管生成等作用。EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）可通过抑制EGFR自身磷酸化而阻断EGFR信号传导通路，从而抑制肿瘤细胞的增殖、分化、促进肿瘤细胞凋亡、减少肿瘤新生血管等，从而实现肿瘤的靶向治疗^[1]。大量研究表明，EGFR-TKI的治疗疗效与EGFR基因突变状况密切相关，可特异性抑制具有EGFR基因突变的肿瘤细胞的生长^[2~3]。EGFR基因定位于第7号染色体短臂（7p12），全长200Kb，由28个外显子组成，突变区域主要位于18~21号外显子，其中外显子19上的746~753密码子缺失突变约占突变的45%，外显子21上的L858R突变约占40%~45%^[4]。在《NCCN非小细胞肺癌诊断治疗指南》明确指明，在进行EGFR-TKI用药前，需进行EGFR基因突变检测。本检测试剂盒用于指导表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）类药物的用药，为非小细胞肺癌患者的个体化医疗提供依据。本试剂盒仅用于对非小细胞肺癌患者EGFR基因常见突变的检测，其检测结果仅供临床参考，不应作为患者个体化治疗的唯一依据，临床医生应结合患者病情、药物适应症、治疗反应及其他实验室检测指标等因素对检测结果进行综合判断。

表1 可检测突变型

Mutation	Exon	Base Change	Cosmic ID	Mutation	Exon	Base Change	Cosmic ID
19del	19	2235-2249del15	6223	19del	19	2239-2247del9	6218
		2235-2252>AAT	13551			2239>2253del15	6254
		2236-2253del18	12728			2239-2256del18	6255
		2237-2251del15	12678			2239-2248>C	12382
		2237-2254del18	12367			2239-2258>CA	12387
		2237-2255>T	12384			2240-2251del12	6210
		2236-2250del15	6225			2240-2257del18	12370
		2238-2255del18	6220			2240-2254del15	12369
		2238-2248>GC	12422			2239-2251>C	12383
		2238-2252>GCA	12419
L858R	21	2573T>G	6224	3Ins20	20	2307-2308insGCCAGCGTG	12376
T790M	20	2369C>T	6240			2319-2320insCAC	12377
G719A	18	2156G>C	6239			2310-2311insGGT	12378
G719S	18	2155G>A	6252	L861Q	21	2582T>A	6213
G719C	18	2155G>T	6253	S768I	20	2303G>A	6241

【检验原理】

本检测试剂盒采用PCR富集液、ARMS（Amplification refractory mutation system）技术与Taqman探针相结合方法检测L858R、19del等EGFR常见突变型。通过对突变位点的PCR富集，进一步提高了检测的分辨率、灵敏度。Taqman探针分别标记一个报告荧光基团FAM和一个淬灭荧光基团BHQ2。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。PCR富集液通过酶切作用，降低了野生型背景序列，进一步提高了检测的分辨率、灵敏度。ARMS方法的特点通过无3’-5’外切酶活性的Taq DNA Polymerase，可特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增发生突变位点的片段，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。因此，采用此种方法可选择性的扩增突变序列，Taqman探针与扩增产物结合，从而鉴定出突变目的序列。

内参反应液选择的检测区域是人EGFR基因外显子2上相对保守的区段，约120bp，作为对试剂、DNA质量以及操作本身的质控，即便DNA有降解，通过内参能够真实地反应体系中基因有效的DNA 量。

检测体系中含有一定比例的dUTP、dNTP和尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG酶）可以打断含有dUTP的PCR产物，从而有效的防止PCR污染。

【储存条件及有效期】

本试剂盒应储存于-18℃以下的避光条件下，有效期为9个月（请于有效期内使用）。开封后，反复融次数不得多于4次，在-18℃以下的避光条件下运输，可稳定保存5天。

生产日期及失效日期见标签。

【适用仪器】

ABI7500荧光定量PCR仪、ABI7300荧光定量PCR仪、QuantStudio®5实时荧光定量PCR系统、LightCycler® 480荧光定量PCR系统、伯乐BioRad CFX96实时荧光定量PCR仪。

【样本要求】

由于肿瘤的异质性，所采集的临床样品往往会混有正常组织细胞，不同类型样品正常细胞混杂程度不同，而且提取的DNA纯度和质量也因样品类型而改变，尤其是用福尔马林固定的石蜡切片样品，福尔马林会对DNA有交联和降解作用，因此请按下面推荐样品类型顺序收集样品并提取DNA用于检测，客户可根据临床实际样品的情况进行选择。

1、推荐样品类型顺序：新鲜肿瘤组织>冰冻病理切片>石蜡包埋病理组织或切片>血浆或血清。

2、从新鲜病变组织中取样应确定含有肿瘤组织，建议含量在30%以上。

3、石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞（建议含量在30%以上），所取部分尽量在蜡块中部，石蜡切片数应不少于3张，厚度在5-10 μm。且手术切除的组织应尽快在4-10%的福尔马林中固定，固定时间以8-24 小时为宜；包埋前应进行彻底脱水。所用石蜡包埋病理组织或切片样品一般请选择保存尚未超过3年的样品。

4、取患者不少于5 ml 外周血样本于EDTA 抗凝管中。轻微颠倒混匀后，4 小时以内完成血浆分离工作；若将外周血置于分离胶促凝管中（金黄色管盖），轻微颠倒混匀后，静置凝固后离心获得血清。

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