　　登革热(dengue fever, DF)是由登革热病毒(denguevirus, DENV)引起的急性传染病，包括四种血清型，DENV-1型、DENV-2型、DENV-3型、DENV-4型，主要通过蚊虫叮咬传播[1]。临床表现主要为高热、头痛、肌肉和关节痛、皮疹、淋巴结肿大及白细胞减少等，严重者可出现出血或休克，甚至死亡[2-3]。因此登革热病毒的快速诊断是治疗登革热的的关键，建立简便、特异、快速的病原学诊断方法，在登革热临床诊断中具有重要意义[4]。

　　试剂盒检测结果不作为患者登革热病毒感染诊断的唯一指标，须结合患者临床表现和其他实验室检测结果综合分析。

【检验原理】

　　本试剂盒采用酶切探针恒温扩增技术(Enzymatic Probe Isothermal Amplification，EPIA)，对登革热病毒的高度保守区域设计特异性引物与rProbe探针，探针标记FAM荧光基团，3’标记BHQ1淬灭基团，通过Bst酶的DNA聚合酶活性和链置换活性等温扩增待测靶标，rProbe结合到相应的待测目标序列上，形成探针-目标核酸杂交双链，RNaseH切割探针-目标核酸杂交双链中的RNA碱基，使得RNA碱基及其右侧的含有淬灭基团的探针片段游离出去，产生荧光，而在RNA碱基左侧的含有荧光基团的片段仍然保持形成杂交链且可作为引物继续延伸，实现产物形成与荧光信号累积同步，可在60min内实现对样本中登革热核酸的定性检测，实现对样本中登革热病毒核酸的定性检测。

【主要组成成分】

编号	组成成分（50人份/盒）	规格×数量	组成说明
1	DENV核酸反应液	1mL /支×1支	恒温扩增反应试剂及检测引物、探针、RNaseH配制得到。
2	DENV检测酶液	40μL/支×1支	Bst X RNA Polymerase，逆转录酶。
3	DENV阳性对照品	600μL/支×1支	登革热假病毒稀释溶液。
4	DENV阴性对照品	600μL/支×1支	无RNase和DNase水。

　　注：不同批号试剂盒中各组份不可以互换。

　　需自备试剂：天根生化科技(北京)有限公司的病毒RNA 提取试剂盒(DP315-R)或QIAGEN的QIAamp Viral RNA Mini Kit(52904);江苏宏微特斯医药科技有限公司的核酸提取试剂。

　　自备试验材料：1.5mL无RNase和DNase的离心管、无RNase和DNase Tip头、台式离心机、台式震荡混合器。

【储存条件及有效期】

　　本试剂盒应储存于-18℃以下的避光条件下，有效期9个月(请于有效期内使用)。开封后效期为3个月，反复融次数不得多于4次，在-18℃以下的避光条件下运输，可稳定保存5天。

【适用仪器】

　　ABI7500荧光定量PCR仪、上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪

【样本要求】

　　1. 样本采集：新鲜血清

　　血清样本采集：采集血液样本，并将其置于不含抗凝剂的试管内，室温下自然凝集20-30min，轻轻地用木棉棒沿着试管壁分离血凝块，密封试管，以2000-3000rpm的速度离心10min，用毛细移液管将血清移出，血清置于标记有日期、采集时间、动物名称和病历号的试管内，标记好样本名称(或编号)及样本类型。

　　2. 存放

　　采集的样本应尽量在4h内送检，待测样本在2~8℃保存不应超过一周;短期内无法检测的样本则应置于-18℃以下保存，保存时间不超过6个月，-70℃以下长期保存。

　　3. 运输

　　样本运送时建议采用泡沫箱加干冰密封进行低温运输，避免冻融，样本运输应遵守国家关于三类病原体的相关生物安全规定。

【检验方法】(使用前请仔细阅读本操作流程)

　　1 扩增试剂准备

　　取出DENV核酸反应液和检测酶液，室温平衡溶解，颠倒混匀，简短离心;根据需要的试剂反应数目N(N=样本数目n+阳性对照品+阴性对照品);按照下表配制扩增试剂，混匀短暂离心后分装到八联反应管中。

成分	DENV核酸反应液	DENV检测酶液
扩增试剂比例	19.3μL×N	0.7μL×N

　　2 样本处理

　　取1.5mL无RNase和DNase的离心管，依次标记为阴性对照品、待测样本、阳性对照品，严格按照提取试剂的说明书进行后续样本核酸的提取操作。(阳性对照品及阴性对照品需与样本等量同时提取)。提取样本的RNA，应尽快检测，若无法立即检测应在-70℃以下保存。

　　3 加样

　　在所设定各八联反应管中加入步骤2中提取的RNA各10μl，压紧管盖，2000rpm 离心10sec。将八联反应管放入荧光PCR 检测仪内，记录加样顺序。

　　4 实时恒温扩增程序

　　4.1 荧光通道选择

　　1) 选择FAM通道(Reporter： FAM， Quencher： None)检测DENV核酸;

　　2) 反应体积(Sample Volume)为30µL。具体检测通道设置可参照各仪器使用说明

　　4.2 扩增条件设置

步聚	温度	时间	循环数	收集荧光信号
1	50℃	30 min	1	否
2	63℃	1min	30	是

　　5 结果分析

　　Tt 值：每个反应管内的扩增曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

　　阈值(threshold)：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照曲线(无规则的噪音线)的最高点为准，FAM阈值应分别设定。

　　5.1 ABI7500荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：仪器可自动调节基线。

　　阈值(threshold)设定：对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时，首先选中检测的阴性对照品，去掉勾选的自动阈值线，将选项“☑Auto”改为“□Auto”，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

　　5.2 上海宏石SLAN-96P荧光定量PCR仪基线及阈值设定方法

　　基线(baseline)设定：在“创建项目”→“实验参数”中的基线起点设为2，终点设为4。若待检样本中最小Tt值<4，需根据实际结果进行调整，具体如下：设定某通道基线时，将“基本参数”中的 “基线终点”调至小于Tt值即可。

　　阈值(threshold)设定：对各通道阈值应分别进行设定。设定某通道阈值线时，首先将 “基本参数”中的 “基线优化”设定为手动优化，然后手动调整阈值线，以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点为准。

　　5.3 质量控制：

　　1)阴性对照品：FAM通道应无典型S型曲线或无数值。

　　2)阳性对照品： FAM通道应呈典型S型曲线且Tt值应不大于28。

　　以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

【阳性判断值或者参考区间】

　　采用ROC曲线分析的方法对试剂盒检测的临界值进行分析，确定本试剂盒检测登革热病毒的阳性判断值为Tt值<30;

【检验结果的解释】

　　如果检测样本FAM通道有明显扩增曲线，且Tt值<30，则判断为登革热病毒核酸阳性。

　　如果检测样本FAM通道无扩增信号，则判断为登革热病毒核酸阴性。

【检验方法的局限性】

　　1. 本试剂盒检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

　　2. 不合理的样本采集、转运、储存及处理过程均有可能导致错误的检测结果。

　　3. 扩增产物的污染和核酸提取中标本间的交叉污染，很容易出现假阳性结果。因此，临床实验室应严格按照《临床基因扩增实验室工作规范》配备设备及操作人员，应严格按照说明书要求进行操作。

　　4. 检测为阴性，并不代表该患者没有感染登革热病毒，具体诊断结果须结合其他临床诊断结果判断。造成检测为阴性的可能是：①不合理样本采集、转运及处理;②样本中病毒滴度过低;③病毒检测靶序列的变异;④未经验证的其他干扰因素如：服用抗病毒药物等;⑤患者由其他病毒或细菌引起的感染。

【产品性能指标】

　　1. 试剂盒外观完好，液体组分清亮、透明、无不溶物。

　　2. 试剂盒检测阴性对照品的FAM通道应无典型S型曲线或无数值;检测阳性对照品的FAM通道应有典型S型扩增曲线且Tt值不大于28。

　　3. 检测登革热病毒核酸企业阴性参考品N1~N6，检测结果均为阴性。

　　4. 检测登革热病毒核酸企业阳性参考品P1~P4，检测结果均为阳性。

　　5. 检测登革热病毒核酸企业最低检测限参考品L1~L12，L1~L2、L4~L5、L7~L8、L10~L11检测结果为登革热病毒核酸阳性，L3、L6、L9、L12检测结果为阴性或阳性。

　　6. 重复性：检测登革热病毒企业重复性参考品，计算检测的CV≤10%(n=10)。

　　7. 分析特异性

　　对乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、发热伴血小板减少综合征出血热、新疆出血热、汉坦病毒、丙型肝炎病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒进行交叉反应试验，均未发现交叉反应。

【注意事项】

　　1. 所有涉及登革热病毒的实验活动应严格按照我国实验室生物安全有关规定执行。

　　采集标本应做好个人防护。标本应置于符合国际民航组织规定的A类包装运输材料之中，按照《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》要求运输至具有从事登革热病毒相关实验活动资质的实验室。

　　开展实验室病原学检测相关活动严格按照《人间传染的病原微生物名录》的要求，在相应的生物安全级别实验室开展。病毒培养在BSL-2实验室、动物感染实验在ABSL-2实验室、未经培养的感染材料的操作在BSL-2实验室、灭活材料的操作在BSL-1实验室。

　　2. 本试剂盒仅适用于体外检测。

　　3. 本试剂盒结果会受到样品本身的来源、样品采集过程、样本质量、样本运输条件、样本预处理等因素影响，同时也受到RNA提取质量、荧光定量PCR仪工作状态、操作环境以及当前分子生物学技术的局限性等限制，可能导致得出假阳性或假阴性的检测结果。使用者须了解检测过程中可能存在的潜在错误、准确性的局限性。

　　4. 实验区域请严格分区操作：

　　第一区：PCR前准备区-准备扩增所需试剂;

　　第二区：样本处理区-待测样本和对照品处理;

　　第三区：检测区-扩增检测。

　　各区物品均为专用，不得交叉使用，避免污染;实验后立即清洁工作台。

　　5. 试剂盒内各试剂使用前，充分融化并振荡均匀后请短暂离心。−70℃以下保存的提取RNA，应在加样前置冰上解冻，短暂离心。

　　6. 分装有核酸反应液和逆转录酶的荧光定量PCR八联反应管应压紧管盖迅速转移至样本处理区。加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品黏附于管壁上，加样后应尽快压紧管盖。

　　7. 实验时注意防止外源核酸对试剂的污染，注意先加完样品RNA后再进行阳性对照的操作。推荐在制备反应试剂和添加RNA模板时，使用单独、专用的移液枪和枪头。

　　8. 核酸反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各荧光定量PCR八联反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

　　9. 扩增完毕立即取出荧光定量PCR八联反应管，密封在高压灭菌袋内无害化处理。

　　10. 实验中用过的Tip头请直接打入盛有84消毒液的废物缸内，并与其他废弃物品一同灭菌后丢弃。

　　11. 工作台及各种实验用品定期用0.1%新洁尔灭、75%乙醇或紫外灯进行消毒。

　　12. 实验中所用的离心管、Tip头必须保证无RNase和DNase。

　　13. 实验中所用过的离心管、Tip头必须无害化处理。

　　14. 所有化学药品都具有潜在的危险性。操作时，请穿着合适的实验室工作服、并佩戴一次性手套等防护性措施。使用过的试剂盒为临床废弃物，应该妥善处理。

【参考文献】

　　1. 雷永良, 陈秀英, 叶碧峰等. 实时荧光定量PCR 在登革热病毒快速检测中的应用[J]. 中国病原生物学杂志，2008,3(12): 897-899.

　　2. 白志军，刘建伟，洪文艳等. TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用[J]. 中国媒介生物学及控制杂志，2010,21(3): 229-231-422.

　　3. 谢敏，王彤，谭秀莲，余涛，徐改凤. 登革热147例临床特点分析[J]. 岭南急诊医学杂志,2003,01:22-23.

　　4. 王佃鹏，朱玉兰，刘胜牙等. 登革热病毒多重荧光PCR 检测及基因分型方法的研究[J]. 热带医学杂志，2012, 12(8): 936-939.

【基本信息】

　　注册人/生产企业名称：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　住所：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园)

　　售后服务单位：江苏宏微特斯医药科技有限公司

　　联系方式：

　　电话：0513-80562880

　　传真：0513-80562881

　　邮编：226400

　　网址：http://www.hongweitest.com

　　生产地址：江苏省如东县掘港街道珠江路888号(如东高新区生命健康产业园10号楼一层)

　　生产许可证编号：

　　生产日期、生产批号及有效期至见产品包装盒

【医疗器械注册证编号/产品技术要求编号】

【说明书核准及修改日期】

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